3-8-7- طرز تهیهی محلولها48
1- بافر50x TAE48
2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml)48
3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته49
3-8-8-1-روش Ct مقایسهای برای کمی سازی نسبی50
3-8-6- آنالیز آماری52
فصل چهارم نتایج
4-1- بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق54
4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه55
4-3- بررسی میزان ROS در بیضهی گروه کنترل و آزمون56
4-3-1- اندازه گیری میزان O2 و H2O256
4-4- نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL59
4-5- بررسی وضعیت بیانی ژن Kdm5d در بافت بیضه61
4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه61
4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA62
4-5-3- بررسی بیان کمی ژن Kdm5d در بافت بیضه63
فصل پنجم بحث و نتیجهگیری
5-1- بحث و نتیجه گیری کلی67
5-2- پیشنهادات:70
منابع71
خلاصه انگلیسی80
ضمائم81
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1: انواع آنتیاکسیدانها و مکانیسم عملکرد آنها17
جدول 3-1: ترکیب محیط TCM38
جدول 3-2: ترکیب محیط 38
جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده40
جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونههایRNA43
جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA45
جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA45
جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR47
جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکلهای هر مرحله47
جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واکنش Real-Time PCR51
جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR51
جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق54
جدول 4-2: میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونههای بیضهای با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری58
جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون60
جدول 4-4: دادههای گزارش شده برای آنالیز کمی ژن Kdm5d64
جدول 4-5: آنالیز نتایج Real-Time PCR با استفاده از نرم افزار REST64
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-1: ارتباط بین ATMو P53 در پاسخهای ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو.9
شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری15
شکل 1-3: فشردگی کروماتین قبل از ورود به میوز توسط کمپلکس Smcy-MSH521
شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار32
شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن34
شکل 3-3: روشهای ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آنها36
شکل3-4: اساس روش TUNEL37
شکل 4-1: نمونههای بافت بیضه در موشهای کنترل و آزمون56
شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت(1000×)60
شکل 4-3: نمونه RNAهای استخراج شده از بافت بیضه62
شکل 4-4: محصولات RT-PCR.63
شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه65
فهرست نمودار
عنوان صفحه
نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون.55
نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلولهای بیضهای در یکی از نمونههای گروه کنترل و آزمون57
نمودار 4-3: نتیجه حاصل از بررسی میزان ROS (H2O2 و ̊O2) در نمونههای بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون59
نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونههای اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون61
نمودار 4-5: نمودار بیان نسبی ژنKdm5d.65
استفاده ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن Kdm5d(Smcy
چکیده
ناباروری عمدهترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان در جهان را درگیر میکند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسؤول 40 درصد این دلایل میباشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو و فاکتورهای ژنتیکی نقش اساسی ایفا می کنند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) میتوانند سبب افزایش استرس اکسیداتیوشوند. افزایش استرس اکسیداتیو میتواند موجب اثرات مخربی بر روی عملکرد سیستم تولید مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغییر بیان ژنهای دخیل در اسپرماتوژنز شود.
در این تحقیق با استفاده ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن Kdm5d(Smcy) ایجاد گردید. این ژن در مرحله لپتوتن/زیگوتن میوز به کمک فاکتور ترمیمی MSH5سبب دمتیله شدن هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتین نقش مهمی داشت.پس از تعیین دوز LD50برای t-BHP، به میزان یک دهم آن به مدت 14 روز به موشهای نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری اندازهگیری و میزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجیده و بیان ژن Kdm5d مورد ارزیابی قرار گرفت.
فلوسایتومتری افزایش استرس اکسیداتیو در موشهای گروه تیماری نسبت به گروه کنترل را نشان داد. همچنین میزان شکست DNAدر موشهای گروه تیماری نسبت به گروه کنترل با آزمایش تانل به اثبات رسید. بیان ژن Kdm5d در گروه آزمون از طریق Real time PCR نشان داده شد. کاهش بیان ژن Kdm5d را میتوان به آسیبهای وارد شده به DNA و سایر مکانیزمها از جمله تغییرات اپیژنتیکی که میتوانند در بیان ژنها تاثیرگذار باشند، نسبت داد.
کلمات کلیدی: ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو، ژنKdm5d
مقدمه :
ناباروری عمدهترین مشکل مربوط به سلامت سیستم تولیدمثل در جهان است که حدود 15درصد زوجهای جوان را درگیر میکند. حدود 40% از ناباروریها مربوط به فاکتورهای مردانه است. این عارضه دلایل مختلفی از جمله واریکوسل، عفونت، ضایعات انسدادی، سیستیک فیبروزیس، تومورها و علتهای جدید همانند استرس اکسیداتیو دارد. استرس اکسیداتیو(OS) 1در نتیجه عدم تعادل بین گونههای اکسیژن فعال (ROS)2و آنتی اکسیدانها در بدن میباشد که میتواند از طریق اختلال در فرایند اسپرماتوژنز، عملکرد و ساختار اسپرم(بدشکلی اسپرم، واکنش آکروزومی، آسیب به DNAو عدم لقاح) منجر به ناباروری مردان شود. رادیکالهای آزاد و پراکسیدها ازمتابولیسم اکسیژن در تمام سلولهای هوازی سبب افزایش اکسیدانها در بدن میشوند و می‌توانند با اکسایش ترکیبات درون سلولی، به عملکرد و بقاء سلولها از جمله اسپرمها‌ آسیب برسانند. از عواملی که بهعنوان سد دفاعی سلول، در برابر استرس اکسیداتیو عمل میکنند آنتیاکسیدانها هستند که بهصورت آنزیمی و غیر آنزیمی در سلولهای اسپرم و مایع منی وجود دارند. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو بر بیان ژن Kdm5d است.
فصل اول
کلیات
1- ناباروری
ناباروری3 یکی از مشکلات بالینی میباشد که به دلیل شیوع و اهمیت آن، محققان روی این موضوع متمرکز شدهاند(Comhaire, 1987). ناباروری در یک زوج بطورکلی به عنوان عدم توانایی برای بارداری بعد از یک سال مقاربت بدون جلوگیری تعریف میشود که حدود 15% از زوجین را در گیر میسازد که 40% این ناباروریها مربوط به فاکتورهای مردانه میباشد(Gnoth et al., 2005; Sharlip et al., 2002). ناباروری در مردان بوسیله آنالیز مایع منی4 قابل تشخیص است. طبیعی بودن اسپرموگرام5 – تست تشخیصی که غلظت، تحرک و ریختشناسی اسپرمها را اندازهگیری میکند – عدم حضور سایر اختلالات را ثابت نمیکند(Poongothai, Gopenath, & Manonayaki, 2009). شواهد نشان میدهند که آسیبهای وارده به اسپرم بواسطه گونههای فعال اکسیژن (ROS) یکی از دلایل مهم ناباروری در 30-80 درصد موارد ناباروری مردان محسوب میشوند(Agarwal, Prabakaran, & Allamaneni, 2006).
1-1- علل ناباروری در مردان
علل ناباروری در مردان را میتوان به چند گروه تقسیم کرد:
• اختلال در تعداد و عملکرد اسپرم که این گروه از مردان دارای اسپرمگرام غیر طبیعی هستند.
• ضایعات انسدادی که بیشتر مجاری دیستال را تحت تاثیر قرار میدهد مانند آزواسپرمیای انسدادی که ناشی از عوامل ژنتیکی از جمله فیبروز سیستیک است که موجب عدم مادرزادی مجرای وازدفران شود.
• اختلال در اسپرماتوژنز در نتیجه ضایعه در بافت بیضه در اثر ضربه به بیضه، عفونت شدید مجاری تناسلی، اشعه ایکس و شیمی درمانی است.
• اختلالات اندوکرین که مربوط به غدد درون ریز از جمله هایپوگنادیسم میباشد(Esteves, Miyaoka, & Agarwal, 2011; Wiser, Sandlow, & Köhler, 2012).
• از جمله عوامل دیگر با وجود آنالیز طبیعی مایع منی، سابقه نرمال، معاینه فیزیکی و همینطور رد ناباروری با فاکتور زنانه میتوان به حضور آنتی بادیهای ضد اسپرم، آسیب DNA اسپرم و سطح بالایی از گونههای فعال اکسیژن اشاره کرد(Cummins, Jequier, & Kan, 1994).
1-2- رادیکال‌های آزاد
1-2-1- تعریف و نحوه تشکیل رادیکال‌‌های آزاد
رادیکال‌های آزاد6، ترکیبات شیمیایی حدواسط با طول عمر کوتاه بوده که دارای یک الکترون جفت نشده میباشند، تمام والانس‌های آنها اشباع نشده و در واقع مولکولی غیراشباع هستند که برای به دست آوردن الکترون به مولکولهای پایدار در اطراف خود حمله کرده و الکترون خود را به دست میآورند و بدین ترتیب سبب اکسایش مولکولهای دیگر میشوند و این چرخه ادامه مییابد(Gutteridge & Halliwell, 1999).
1-2-2- نحوه عملکرد رادیکال‌های آزاد
رادیکالهای آزاد از چندین طریق نقش خود را ایفا میکنند:
• یک رادیکال آزاد میتواند به مولکول دیگر حمله کند و با اکسایش آن مولکول خود را احیاء کند.
• یک رادیکال آزاد میتواند به یک مولکول دیگر اضافه شود و یک ترکیب رادیکالی ایجاد کند. به عنوان مثال رادیکال هیدروکسیل می‌تواند به گوانین موجود در DNA اضافه و سبب ایجاد رادیکالی به نام 8- هیدروکسی‌گوانین7 شود.
• یک رادیکال آزاد میتواند اتم هیدروژن را از پیوند هیدروکربنی (C-H) برداشته و اسکلت کربنی را با یک الکترون جفت نشده باقی بگذارد که در سیستم موجود زنده با یکسری واکنشهای زنجیرهای همراه است(Pryor, 1984).
1-2-3- گونههای فعال اکسیژن و نیتروژن
اصطلاح گونههای فعال اکسیژن به رادیکال‌های آزاد اکسیژن یا انواع فعال شده اکسیژن اطلاق می‌شود. اکسیژن برای حفظ عملکرد سلولهای طبیعی هوازی مانند اسپرماتوزوآ لازم است. شکست محصولات گونههای اکسیژن فعال(ROS) میتواند به عملکرد و بقا سلول آسیب رساند(Eve de Lamirande & Gagnon, 1995).

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

گونههای فعال اکسیژن شامل یک طبقه بندی گسترده از جمله : رادیکالها (یون هیدروکسیل، سوپراکسید،اکسید نیتروژن، پراکسیل وغیره) و غیررادیکالها(ازن، اکسیژن تنها ، پراکسیدلیپید، پراکسید هیدروژن) و مشتقات اکسیژن میباشند(Sikka, 2001).
همچنین گونههای فعال نیتروژن شامل: (نیتروژن اکسید، نیتروکسیل ، یون پراکسیدنیتریل وغیره) رادیکالهای نیتروژن آزاد در نظر گرفته شده و زیر کلاس گروه ROS قرار میگیرند(Darley-Usmar, Wiseman, & Halliwell, 1995).
1-2-3-1- نقشهای بیولوژیک ROS
از نقشهای مهم ROS میتوان به موارد زیر اشاره کرد: به عنوان پیامبرهای درون سلولی عمل کرده و در مسیرهای تنظیمکنندهی سلول فعال است، همچنین تنظیم بیان ژنی بهویژه ژن مربوط به پروتئینهای آنتیاکسیدانی را بر عهده دارند(Finkel, 1998; Jones, Hancock, & Morice, 2000). مطالعات زمینهای نشان میدهد ROS در تنظیم بلوغ اسپرم و فسفریلاسیون پروتئینهای انزالی در آغاز تحریک اسپرم نقش مهمی دارد(R. Aitken & Vernet, 1997). بنابراین، حضورROS برای عملکرد عادی سلولها ضروری به نظر میرسد و با توجه به غلظتشان میتوانند اثرات فیزیولوژیک یا پاتولوژیک بر اسپرم داشته باشند.
1-2-4- تولید و منبع رادیکالهای آزاد
عوامل متفاوتی با منشا داخلی و خارجی میتوانند سبب تولید رادیکال آزاد در بدن شوند که این منابع شامل موارد زیر میباشد:
• التهاب و آلودگیهای میکروبی منجر به تولید رادیکالهای آزاد توسط نوتروفیلها و ماکروفاژها میشوند.
• واکنشهای اکسیداسیون احیاء (انتقال الکترون) در میتوکندری: از طریق آنزیمهای کاتالیز شده و همینطور انتقال یونهای فلزی کاتالیز کننده همانند یونهای آهن و مس، سبب تولید رادیکالهای آزاد اکسیژن به عنوان محصول فرعی می شوند.
• آلودگی هوا (مواد شیمیایی موجود در هوا)، آتش سوزی جنگل، فعالیتهای آتشفشانی و سوزاندن ترکیبات آلی طی آشپزی نیز تولید رادیکالهای آزاد را سبب میشوند.
• تشعشع پر انرژی یا یونیزه شده مانند UV، ماکروویو، پرتوهای X و گاما، مصرف الکل و داروهای خاص، استعمال دخانیات، فاضلابهای صنعتی، پنبه نسوز، علف کشها، سموم قارچی، مواد شیمیایی مازاد و استرس، از جمله عوامل دخیل در تولید رادیکالهای آزاد به ویژه ROS میباشند(Agarwal & Allamaneni, 2011).
• مایع منی شامل انواع مختلف سلولها ماننداسپرم بالغ و نابالغ، سلولهای گرد از مراحل مختلف اسپرماتوژنز، لکوسیتهاوسلولهای اپی تلیال می باشد. از بین این سلولهای مختلف لکوسیتهاواسپرماتوزوآی نابالغ به عنوان دو منبع اصلی تولید گونههای فعال اکسیژن شناخته شدهاند(Garrido, Meseguer, Simon, Pellicer, & Remohi, 2004).
1-2-4-1- تولید ROS توسط اسپرماتوزوآی غیر طبیعی
تولید ROS در اسپرم غیر طبیعی به دلیل حفظ سیتوپلاسم اضافی در روند اسپرمیوژنز است که به دو روش ROS را تولید میکنند:
1- سیستم NADPH اکسیداز که در سطح غشای پلاسمایی اسپرم فعال است.
2- NADH اکسیدوردوکتاز که در سطح میتوکندری وجود دارد(R. J. Aitken, Buckingham, & West, 1992).
1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیتها
توانایی لکوسیتها در تولید ROS به میزان فعالیت آنها در پاسخ به تحریکات از جمله التهاب و عفونت بستگی دارد(F. F. Pasqualotto, Sharma, Nelson, Thomas Jr, & Agarwal, 2000). لکوسیتها در برابر این تحریکات فعال شده، تولید NADPH افزایش یافته و در پی این فرآیند، سطح ROS افزایش مییابد(Blake, Allen, & Lunec, 1987).
1-2-5- استرس اکسیداتیو
استرس اکسیداتیو (OS) عبارتست از عدم تعادل بین ROS و آنتیاکسیدانها در بدن که سبب پراکسیداسیون ماکرومولکول‌های داخل سلول شده و منجر به اثرات ثانویه بر عملکرد سلول میشود. رادیکالهای آزاد مانند ROS عاملی برای ایجاد استرس اکسیداتیو میباشند و میتوانند سبب آسیبهای اکسیداتیو شوند(Griveau & Lannou, 1997).
1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو
پس از القاء ROS و استرس اکسیداتیو 3 اتفاق در سلول میافتد:
القاء ROS میتواند موجب بیش از 20 نوع آسیب در DNA شود. عدم ترمیم صحیح DNA توسط سیستمهای ترمیم 8BER، 9NER میتواند باعث جهش ژن مانند جهش نقطهای و پلی مورفیسم شود که میتواند موجب تغییر در عملکرد و بیان ژنها شود(Barroso, Morshedi, & Oehninger, 2000). شایعترین آسیبهای DNA آن موجب تبدیل ترکیب گوانین سیتوزین به آدنین تیمین میشود(Kemal Duru, Morshedi, & Oehninger, 2000).
اگر شکست در دو رشتهی DNA اتفاق بیفتدژن (10ATM) که محصول آن یک پروتئین کینازسرین / ترئونین است فعال شده، در نتیجه منجر به توقف چرخه سلولی، تعمیر DNA به وسیله سیستمهای ترمیم 11NHEJ و 12HR میشود.
گاهی آسیب به حدی زیاد است که سیستمهای ترمیم DNA قادر به ترمیم آن نبوده و باعث القاء آپوپتوز و مرگ سلول آسیب دیده میشود(Wells et al., 2009). (شکل 1-1).
استرس اکسیداتیو

شکل(1-1): ارتباط بین ATMو P53 در پاسخهای ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو.
از علل احتمالی آسیب به DNAی اسپرم میتوان به آپوپتوز ناقص ، عفونت بیضه، اسپرماتوژنز معیوب و استرس اکسیداتیو اشاره نمود(Bhuller & Wells, 2006).
1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو
تمام اجزای سلولی ازجمله چربیها، پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و قندها از اهدف استرس اکسیداتیو هستند. میزان آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو به مقدارROS درگیر شده و عوامل خارج سلولی مانند دما، فشار اکسیژن و ترکیبات محیط اطراف از جمله یونها، پروتئینها و جاذب ROS بستگی دارد(Cocuzza, Sikka, Athayde, & Agarwal, 2007).
1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA
آسیب DNA اسپرم به دو صورت میباشد:
آسیبهای تک رشته DNA که اشعههای یونیزان و اختلال در بازسازی DNA اسپرم این نوع آسیبها را ایجاد میکنند.
آسیبهای دو رشتهای DNA که فعالیت کاسپازها و آندونوکلئازها و اثر مستقیم13ROS بر رشته DNA علت این نوع آسیبها در دو رشته DNA میباشند و منجر به آپپتوز ناقص میشوند(Sakkas & Alvarez, 2010).
اولین گزارش منتشر شده در مورد اثرات ROS بر روی اسپرم، نیم قرن پیش بوده است. تولید بیش از حد ROS سبب پراکسیداسیون لیپیدی، آسیب به DNA و کاهش ظرفیت تولیدمثل14میشود(Makker, Agarwal, & Sharma, 2009).
در مطالعات مشخص شده است که اسپرماتوزوآ بالغ انسان اغلب سطوح بالایی از قطعه قطعه شدن DNA را نشان میدهد که این آسیب DNA، یک عامل مهم در تعیین عملکرد اسپرم میباشد و با طیف گستردهای از عوارض جانبی بالینی در ارتباط است. از جمله این عوارض میتوان به افزایش اختلالات در مرحلهی لقاح و پیش از لانه گزینی،کم شدن میزان لانه گزینی، نقص در رشد و نمو جنین و بروز سقط جنین اشاره کرد(R. Aitken & De Iuliis, 2010).
بازهایDNA به آسیب اکسیداتیو حساس بوده که در نتیجه سبب قطعه قطعه شدن DNA و آسیب جزیی در DNAسلولها مانند اسپرم میشوند که میتواند منجر به عوارضی در فرزندان از جمله : بیماریهای ژنتیکی غالب مانند آکندروپلازیا، شرایط عصبی پیچیده مانند اسکیزوفرنی، صرع، بیماری دو قطبی، اوتیسم و با افزایش ناهنجاریهای مادرزادی سبب افزایش نرخ مرگ و میر و سقط میشود(Singh, Muller, & Berger, 2003).
هنگامیکه آسیب اکسیداتیو وسیع باشد، آپوپتوز یا مرگ برنامهریزی شده سلول15 و فراگمنته شدن ژنوم جنین رخ میدهد و در مواقعی که آسیبهای اکسیداتیو کمتر است، لقاح اتفاق میافتد اما اووسیت باید شکستهای DNA را ترمیم کند(Kodama, Yamaguchi, Fukuda, Kasai, & Tanaka, 1997).
آپوپتوز یا مرگ برنامهریزی شده سلول، یک پاسخ غیرالتهابی به آسیبهای بافتی است که توسط یکسری تغییرات بیوشیمیایی و ریختشناختی16 مشخص میگردد. این فرآیند ظرفیت سلولهای سرتولی را از طریق کنترل تولید بالای گامتهای نر و حذف اسپرماتوزوآهای غیرطبیعی حفظ مینماید. ROS با فعالسازی کاسپازها یک واکنش زنجیرهای را آغاز میکنند و سرانجام منجر به آپوپتوز میگردند(Agarwal, Makker, & Sharma, 2008).
همچنین ROS میتواند به DNAی میتوکندریایی نسبت به DNAی هستهای آسیب بیشتری برساند. بعد از القای ROS، آسیبهای وارده به DNA افزایش یافته و از طریق فعال شدن سیتوکروم C و در نهایت فعال شدن کاسپاز3 در تمام سلولهای زایا از جمله اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتوسیت ثانویه، اسپرماتوگونیا و اسپرماتوزوآ، آپوپتوز مشاهده میشود. در نتیجه تعداد اسپرم کاهش یافته و حالت اولیگواسپرمی ایجاد میشود. گمان میرود که چنین آسیبهایی میتوانند عامل بیماریهایی چون ناباروری در انسان باشند. مجاورت نزدیکDNAی میتوکندری به زنجیره انتقال الکترون، مکانیسمهای ناکارآمد ترمیم DNA و فقدان هیستونها که مسبب فشردگی ساختار کروماتین هستند، به عنوان دلایل حساسیت DNAی میتوکندری پیشنهاد میشوند(George, Jiao, Bishop, & Lu, 2012).
1-2-6-1-2- اهمیت سلامت DNA اسپرم
تراکم کروماتین اسپرم نقش مهمی در حفاظت از ژنوم پدر، در فرآیند لقاح و باروری تخمک دارد. در نتیجه بررسی سلامت DNAاز اهمیت خاصی برخوردار است.
همچنین در تحقیقات گذشته نشان داده شده است که:
• بین پارامترهای اسپرم وآسیبهایDNA رابطه معکوس وجود دارد(R. Mahfouz et al., 2010).
• در افراد نابارور میزان شکستDNA بیشتر است(Turner & Lysiak, 2008).
• بین میزان لقاح و آسیبDNA رابطه معکوس وجود دارد(Agarwal & Allamaneni, 2005).
• در همسران بیمارانی که دارای میزان قابل توجهی شکستDNA اسپرم هستند میزان سقط افزایش مییابد(Jiang, He, Wang, & Zhu, 2011).
از این رو بررسی و ارائه راهکارهایی در زمینه آسیب DNAی اسپرم میتواند برای درمان زوجهای نابارور حیاتی باشد.
1-2-6-2- استرس اکسیداتیو در اسپرم
اسپرماتوزوآ نیز همانند دیگر سلولهایی که در شرایط هوازی زندگی میکنند، با تضادی در مورد اکسیژن مواجه است. یعنی از یک سو برای بقاء خود به اکسیژن نیازمندند و از سوی دیگر متابولیتهای اکسیژن نظیر ROSها میتوانند برای بقاء سلول مضر باشند. در نتیجه ROS تولید شده در سلول باید مدام غیرفعال شود به طوری که غلظت آن همیشه در حد بسیار اندک برای عملکرد طبیعی سلول باشد و اگر تعادلی بین تولید و حذف ROS نباشد، منجر به ایجاد شرایط استرس اکسیداتیو میشود(Saleh & HCLD, 2002; Turner & Lysiak, 2008).
در واقع به علت این که میزان سیتوپلاسم اسپرم بالغ کم است و غلظت آنزیمهای از بین برندهی ROS در اسپرم اندک میباشد، اسپرم بیش از دیگر سلولها مستعد ایجاد استرس اکسیداتیو است. در ضمن، به علت این که غشاء اسپرم حاوی مقادیر بالایی از اسیدهای چرب غیراشباع میباشد، آسیبپذیری آن در برابر استرس اکسیداتیو زیاد است. همچنین به دلیل شکل خاص اسپرم، آنزیمهای آنتیاکسیدان داخل سلولی نمیتوانند غشاء پلاسمایی احاطه کنندهی آکروزوم و دم را حفاظت نمایند(Fanaei, Azizi, & Khayat, 2013).
1-2-6-3- استرس اکسیداتیو و بیماریهای دیگر
استرس اکسیداتیو در دیگر بیماریهای انسان از جمله: آترواسکلروز، سرطان، دیابت، آسیب کبدی، روماتوئید آرتریت، آب مروارید،ایدز، بیماریهای التهابی روده، پارکینسون، بیماری نورون حرکتی و شرایط مرتبط با تولد زودرس دخیل است( Pasqualotto, F et al., 2000).
1-2-7- اثراتROS
1-2-7-1- پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم
اسیدهای چرب که حاوی بیش ازدوکربن با پیوند دو گانه هستند اسیدهای چرب غیر اشباع (PUFA17) نامیده میشوند. لیپیدهای موجود درغشای پلاسمایی اسپرم که به شکل اسیدهای چرب غیر اشباع هستند از حساسترین مولکولها میباشند. حملات ROSبه PUFA در غشای سلولی منجر به شروع آبشاری ازواکنشهای شیمیایی بنام پراکسیداسیون لیپیدی میشود که این پراکسیداسیون لیپیدی برای تحرک اسپرم، ظرفیتیابی اسپرم و نفوذ به اووسیت ضروری میباشد(J. Aitken, Buckingham, & Krausz, 1994; R. J. Aitken, Clarkson, & Fishel, 1989).
1-2-7-2- اثر روی تحرک اسپرم
پراکسیداسیون لیپیدی یک علت عمده برای از دست دادن تحرک دراسپرم است، در نتیجه افزایش سطح ROS با کاهش تحرک اسپرم ارتباط دارد. با این حال، مکانیسم دقیقی برای این رویداد مشخص نیست.
یک فرضیه حاکی از آن است که H2O2 از سراسر غشاء به داخل سلولها منتشر شده و مانع از فعالیت برخی آنزیمهای حیاتی مانند گلوکز 6- فسفاتدهیدروژناز (G6PD) میشود و از طریق شنت هگزوز منوفسفات، دسترسی درون سلولی نیکوتین آمید آدنین دینوکلئوتید فسفات (NADPH) را کنترل میکند. NADPH به عنوان یک منبع الکترون توسط اسپرم برای تولید ROSاستفاده میشود. مهار G6PD منجر به کاهش NADPH و تجمع گلوتاتیون اکسیده میشود که میتواند دفاع آنتیاکسیدانی اسپرماتوزوآ را کاهش و پراکسیداسیون فسفولیپیدهای غشاء را افزایش دهد(Gomez, Irvine, & Aitken, 1998; Suleiman, Ali, Zaki, EL‐MALIK, & Nasr, 1996)
1-2-8- ROS و استرس اکسیداتیو مایع منی
هنگامیکه تعادل بین ROS تولیدی و آنتی اکسیدانها از بین میرود، آسیبهای اکسیداتیو قابل توجهی برای اکثر ارگانلهای سلولی به دلیل آسیب دیدن کربوهیدراتها، پروتئینها، لیپیدها و DNA رخ داده و در نهایت منجر به مرگ سلول میشود. غشای پلاسمایی اسپرم غنی از اسیدهای چرب غیراشباع است و به راحتی توسط ROS، تحت پراکسیداسیون لیپیدی قرار میگیرد. لوکوسیتها و اسپرماتوزوآی نابالغ موجود در منی، H2O2 را از طریق سیستم NADPH اکسیداز تولید میکنند. پراکسیداسیونH2O2 سمیترین شکل ROS برای اسپرماتوزوآ میباشد و به علت نفوذ به غشا بهراحتی ارگانلهای سلولی را تحت تاثیر قرار میدهد. این در حالی است که غشا نسبت به رادیکال هیدروکسیل نفوذناپذیر بوده و اثر نمودن آنها زمانبر است. در بافتی مانند بیضه با متابولیسم بالا، استرس اکسیداتیو میتواند آسیبرسان باشد، بنابراین ظرفیت آنتیاکسیدانهای بافت بسیار مهم است.
امروزه مطالعات زیادی مبنی بر اینکه استرس اکسیداتیو در حضور آنتیاکسیدانها بر عملکرد اسپرم طبیعی تاثیر نداشته و در نتیجه باروری اتفاق افتاده است، وجود دارد( Pasqualotto, F et al., 2000) .
1-2-9- ROS و ناباروری
بطور معمول در مردانی که علت ناباروری آنها ناشناخته است، برهم خوردن توازن بین ROS و آنتیاکسیدانها، از دلایل محتمل ناباروری است(Agarwal et al., 2006). طی مطالعات اخیر، در نمونههای منی 25 تا 40 درصد مردان نابارور مقادیر بالایی از ROS گزارش شده است. همچنین در نمونههای منی مردان بارور، ظرفیت کلی آنتی‌اکسیدانی18 (TAC) بالاتر از مردان نابارور است(Lewis, Boyle, McKinney, Young, & Thompson, 1995). از طرف دیگر، نیمی از مردان اولیگواسپرمی، سطح بالایی از ROS را در مایع منی نشان میدهند(R. J. Aitken et al., 1989). حمله ROS به اسپرم، سبب کاهش بقا و افزایش نقص در شکل ظاهری اسپرم میشود(E De Lamirande & Gagnon, 1992)،که این آسیب وارده به عوامل متفاوتی نظیر مقدار و مدت زمان تماس سلول با عامل اکساینده، اکسیژن، دما، غلظت یون‌ها، پروتئین‌ها و مهارکننده‌های ROS بستگی دارد. در مطالعاتی مشخص شده است که غلظت پائین پراکسید هیدروژن، روی تحرک اسپرم اثری ندارد، اما از نفوذ اسپرم به اووسیت ‌جلوگیری می‌کند(R. Aitken, Harkiss, & Buckingham, 1993).
شکل(1-2): ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری(Singh et al., 2003).
1-2-10- آنتی اکسیدانها
از عوامل از بین برندهی رادیکالهای آزاد میتوان به آنتی اکسیدانهااشاره کرد که بهعنوان سد دفاعی سلول، در برابر استرس اکسیداتیو عمل میکنند. آنتیاکسیدانها به پنج گروه تقسیم میشوند:
1) ترانسفرین19، هموپکسین20 از پروتئینهایی هستند که سبب کاهش دسترسی سلول به پیش اکسیدانهایی مانند آهن و مس میشوند.
2) آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز21(SOD) از جمله عواملی هستند که سبب از بین بردن رادیکالهای آزاد و دیگر انواع ROS میشوند.
3) پروتئینهایی که سبب حفظ مولکولهای زیستی در برابر استرس اکسیداتیو میشوند، مانند: پروتئینهای شوک حرارتی22.
4) α-توکوفرول23، گلوتاتیون از مولکولهایی هستند که دارای وزن مولکولی پائین بوده و میتوانند ROS را به دام اندازند.
5) ویتامینهای E و C ازجمله عواملی هستند که به صورت غیرآنزیمی در بیضه به عنوان آنتیاکسیدان عمل میکنند(Agarwal & Sekhon, 2010).
1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتیاکسیدانها به دو روش طبقه بندی میشود:
• شکستن زنجیره: زمانی که یک رادیکال آزاد الکترونی را جذب کرده یااز دست میدهد، رادیکال دوم تشکیل میشود. سپس این مولکول همین کار را با مولکول سوم انجام میدهد. این روند تا زمانی ادامه مییابد که طی آن رادیکال بوسیله یک آنتیاکسیدان شکننده زنجیره مانند بتا کاروتن و ویتامینها تثبیت شود، یا بهراحتی به یک محصول بی ضرر تبدیل شود.
• راه بازدارنده: آنزیمهای آنتیاکسیدان مانند سوپراکسید دسموتاز ، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز با کاهش میزان تشکیل زنجیره از اکسیداسیون جلوگیری میکنند. چنین آنتیاکسیدانهایی با یافتن رادیکالهای آغازگر میتوانند یک زنجیره اکسیداسیون را برای همیشه متوقف سازند. همچنین میتوانند با تثبیت رادیکالهای فلزی مانند مس و آهن از اکسیداسیون جلوگیری کنند(Agarwal, Nallella, Allamaneni, & Said, 2004).
عمدهترین آنزیمهای آنتیاکسیدانی که در بافت بیضه پستانداران بیان میشوند عبارتند از: سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز(Zini & Schlegel, 1997). همچنین برخی عوامل غیرآنزیمی که به عنوان آنتیاکسیدانی در بیضه عمل میکنند میتوان به ویتامین C، ویتامین E و ملاتونین اشاره کرد که در کاهش استرس اکسیداتیو بیضه موثر میباشند(Choudhary, Chawala, Soni, Kumar, & Vyas, 2010; Lewin & Lavon, 1997; Park, Park, Lee, & Shin, 2003; Uguralp, Usta, & Mizrak, 2005; Zini & Schlegel, 1997).
در جدول (1-1) مکانیسم عملکرد برخی از آنتی اکسیدانهای مهم ذکر شده است.

جدول(1-1): انواع آنتیاکسیدانها و مکانیسم عملکرد آنها(Choudhary et al., 2010)
مکانیسم عملکردآنتیاکسیداناین ویتامین اصلیترین آنتیاکسیدان شکننده زنجیره در غشاء پلاسمایی است و به طور مستقیم آنیون سوپراکسید، پراکسیدهیدروژن و رادیکال هیدروکسیل را خنثی میکند، همچنین پراکسیداسیون لیپیدی را سرکوب کرده و احتمال ادغام شدن اسپرم و تخمک را افزایش میدهد.ویتامین Eاین ویتامین نیز همانند ویتامین E نقش شکننده زنجیره را در غشاء پلاسمایی دارد و از لیپوپروتئین در مقابل رادیکالهای پراکسیل محافظت میکند.ویتامین Cآنیونهای سوپراکسید راخنثی کرده و میزان واکنش آکروزومی را بهبود میبخشد همچنین سبب افزایش تحرک اسپرم میشود.سوپراکسید دیسموتازپراکسیدهیدروژن راخنثی کرده و میتواند فقدان تحرکی که توسط لوکوسیتهای تولید کنندهی ROS به وجود آمده را کاهش دهد.کاتالازمولکولی است که سبب احیای H2O2 و سایر پراکسیدها میشود.گلوتاتیونآنتیاکسیدان غیرآنزیمی است که یک عامل بالابردن انرژی است و مانع از آسیب پراکسیداتیو میشود.کوآنزیمQ10
1-2-11- اثرات آنتیاکسیدانها

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب(به صورت کاملا تصادفی و به صورت نمونه) با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود-این مطالب صرفا برای دمو می باشد

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم
آنتیاکسیدانهایی مانند ویتامین E و C، گلوتاتیون، کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز و آلبومین مانع کاهش تحرک اسپرم و کوآنزیم Q سبب افزایش تحرک اسپرم میشود. طی مطالعهای ثابت شده است که نمونه اسپرم انکوبه مرد نابارور با 50میکروگرم از کوآنزیم Q، سبب بهبودی در تحرک اسپرم میشود(Lewin & Lavon, 1997).
1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیبهای بعد از انجماد اسپرم
روش انجماد اسپرم و ذوب شدن آن سبب کاهش قابل توجه و غیر قابل برگشت تحرک و فعالیت متابولیک اسپرم همراه با اختلال در غشای پلاسمایی میشود. بر اساس مطالعه در خصوص درمان با ویتامین E (10 میلی مول/لیتر) که در کاهش آسیب ناشی از انجماد اسپرم موثر است. مشاهده شد که مکمل آزمایشگاهی (300 میلی مول/لیتر) Rebamipide در نمونه مایع منی در طول انکوباسیون (C̊37) و انجماد (C̊ 196 -به مدت سه روز)، منجر به کاهش معنیدار سطحROS میشود(Park et al., 2003).
1-2-11-3- تاثیر آنتیاکسیدانها در جلوگیری از آسیب بهDNA
آنتی اکسیدانها به کاهش قطعه قطعه شدن DNA ناشی از ROSکمک میکنند. بر اساس مطالعات درمانی، مصرف مکمل های خوراکی روزانه به میزان 1 گرم ویتامین C و E به مدت 2 ماه کاهش تعداد قطعه قطعه شدن DNA را از 1/22٪ به 1/9٪ را به همراه دارد. علاوه بر این، پس از درمان با آنتیاکسیدان، بارداری شیمیایی (2/48٪ در برابر 9/6٪) و حاملگی بالینی (2/48٪ در برابر 9/6٪) و لانه گزینی (6/19٪ در برابر 2/2٪) بهبودی قابل توجهی را در مقایسه با نتایج پیش از 24 ICSI ارائه دادند.آلبومین نیز با خنثی نمودن پراکسیداسیون لیپیدها مانع از آسیب به غشای پلاسمایی اسپرم و DNA میشود(Twigg et al., 1998).
1-2-12- نقش آنتیاکسیدانها (ربایندههای25بالقوهROS) دراسپرم
ازآنجائیکه ROS دارای نقشهای فیزیولوژیک متفاوتی میباشد، حضورآنتیاکسیدانها حالت پایداری از ROS را در پلاسمای منی ایجاد مینمایند. آنتیاکسیدانهابه صورت فعال، رادیکالهای آزاد را جهت حفظ اسپرماتوزوآ در مقابل ROS از بین میبرند. این آنتیاکسیدانها درهنگام خروج سیتوپلاسم طی اسپرمیوژنز26، فقدان آنزیمهای سیتوپلاسمی اسپرم راجبران مینمایند. در میان آنتیاکسیدانهای بیولوژیکی شناخته شده، سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز نقش مهمی دارند. سوپراکسیددیسموتاز سبب تبدیل مبدل آنیون.O2- به O2 و H2O2میشود. کاتالاز H2O2 را به O2وH2O تبدیل میکند(Choudhary et al., 2010).
آنزیم SOD ، از طریق حذف رادیکالهای سوپراکسید، از بیش فعال سازی پیش از بلوغ اسپرم27وظرفیتگیری28آ (مرحله ما قبل آخر در بلوغ اسپرماتوزوآ که جهت لقاح با تخمک ضروری است) قبل ازانزال جلوگیری مینماید و در نهایت از پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی جلوگیری بعمل میآورد( Aitken, R et al., 1997).
آنزیم کاتالاز، -NO که القا کننده ظرفیتگیری اسپرم است- را نیز فعال مینماید که یک مکانیسم پیچیده درگیرکننده H2O2 میباشد( Aitken, R et al., 1997).
سیستم گلوتاتیونپراکسیداز/ردوکتاز،سیستم دفاعآنتیاکسیدانی است که غشای پلاسمایی اسپرماتوزوآ را در مقابلH2O2 ، که مسئول شروع پراکسیداسیون لیپیدی است، محافظت میکند. مکانیسم این سیستم به این صورت است که گلوتاتیون پراکسیداز (Se-GSH-Px) بااستفاده ازگلوتاتیون (GSH) به عنوان دهنده الکترون، رادیکالهای پراکسیل (ROO) را از منابعی چون H2O2 حذف مینماید. سپس گلوتاتیون ردوکتاز (GSH-Red)، GSSG اکسید شده را بهGSH احیا مینماید(Gavella, M, et al 1992; Meybodi, A, et al, 2012).
پیرو نتایج بدست آمده،درمان بیماران آستنواسپرمیا با آنتیاکسیدانها سبب بهبود کیفیت اسپرم در روشهای کمک باروری از جملهIVF میشود(Mozdarani & Meybodi, 2004).
ویتامین E آنتیاکسیدان اصلیدرغشای اسپرم میباشد و ظاهرا اثر وابسته به دوز دارد. نحوهی عملکرد این ویتامین به صورت شکنندهی زنجیره اکسیداسیون است و در حقیقت رباینده رادیکالهای آزاد، سوپراکسید، پراکسیدهیدروژن و هیدروکسیل میباشد.
ویتامین C نیز یکی ازآنتیاکسیدانهای موجود در مایع منی است که رادیکالهای آزاد را خنثی میکند، همچنین از آسیبهای ایجاد شده در DNA توسط H2O2 جلوگیری میکند.
آنتیاکسیدانهایی چون ویتامین E و C، گلوتاتیون،N –استیل سیستئین،SOD ،کاتالاز، آلبومین، تائورین و هیپوتائورین مانع مرگ و میر اسپرم میشوند(Choudhary et al., 2010).
1-3- ژنتیک و ناباروری مردان
در سال 1970 نقشه کروموزوم Y و ارتباط اسپرماتوژنز با بازوی بلند کروموزوم Y مشخص شد. بخش عمدهای از ناباروری مردان دارای علل ژنتیکی است. در روی بازوی بلند کروموزوم Y ناحیهای بنام AZF29 قرار دارد که دارای سه بخش AZFa، AZFb، AZFc است و ژنهای مهمی در این نواحی وجود دارند. حذف هر کدام از این ژنها، در روند تولید اسپرم تاثیرگذار است و از دلایل اصلی در ناباروی مردان میباشد(Painter, 1921; Skaletsky et al., 2003; Stern, 1957).
1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه
Kdm5dیا Smcy
ژن30Kdm5d یا Smcyدر ناحیه SXra موشی که معادل ناحیه AZFb انسانی است، قرار دارد و یکی از اعضاء خانواده پروتئینی JARID131 است و از 27 اگزون که شامل4620 جفت باز میباشد تشکیل شده است. این ژن کدکننده یک هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) دمتیلاز است که طی اسپرماتوژنز با فاکتور MSH532 که یک فاکتور ترمیم DNA است، یک کمپلکس پروتئینی تشکیل میدهد. این کمپلکس طی مرحله لپتوتن/زیگوتن بر روی DNA مستقر میشود و در تغییر حالت کروماتین سلول زایای مردانه نقش ایفا میکند. پروتئین KDM5D با دمتیله کردن H3K4 دی و تری متیله، ممکن است در تغییر فشردگی کروموزوم طی میوز موثر باشد(شکل 1-3).
شکل(1-3): فشردگی کروماتین قبل از ورود به میوز توسط کمپلکس Smcy-MSH5(Akimoto, Kitagawa, Matsumoto, & Kato, 2008).
این خانوادهی پروتئینی، با دمتیله کردنH3K4 به طور اختصاصی هیستونهای دی و تری متیله را دمتیله میکند و سبب فشردگی کروموزوم قبل از ورود به میوز در طی فرایند اسپرماتوژنز میشود. نقص اسپرماتوژنز که به دلیل حذف ژن Kdm5d رخ میدهد، میتواند تأیید کننده نقش این ژن در فرآیند اسپرماتوژنز باشد. این ژن علیرغم نقشهایی که به طور ویژه در سلول زایای مردانه ایفا میکند، در همه بافتها بیان میشود(Akimoto et al., 2008; Kent-First et al., 1996).

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید